中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
SN/T 5760.5—2024
進出口化妝品中病原菌檢測方法
微滴式數(shù)字PCR 法
第5 部分：洋蔥伯克霍爾德氏菌
Droplet digital PCR method for detection of pathogens in cosmetics for
import and export—
Part 5: Burkholderia cepacia
ICS 71.100.70
CCS Y 42
中華人民共和國海關(guān)總署發(fā) 布
2024-12-16 發(fā)布2025-06- 01 實施
I
前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1 部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)
定起草。
本文件為SN/T 5760—2024《進出口化妝品中病原菌檢測方法 微滴式數(shù)字PCR 法》的第5 部分。
SN/T 5760— 2024 已經(jīng)發(fā)布了以下部分：
——第1 部分：大腸埃希氏菌；
——第2 部分：金黃色葡萄球菌；
——第3 部分：銅綠假單胞菌；
——第4 部分：肺炎克雷伯氏菌；
——第5 部分：洋蔥伯克霍爾德菌；
——第6 部分：沙門氏菌；
——第7 部分：白色念珠菌；
——第8 部分：破傷風(fēng)梭菌；
——第9 部分：檸檬酸桿菌；
——第10 部分：嗜麥芽窄食單胞菌。
請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。
本文件由中華人民共和國海關(guān)總署提出并歸口。
本文件起草單位：廣州海關(guān)技術(shù)中心、廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所、廣州國際旅行衛(wèi)
生保健中心、中國食品藥品檢定研究院、長春海關(guān)技術(shù)中心、中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心。
本文件主要起草人：凌莉、董潔、劉婧文、林雅慧、冼鈺茵、黃成棟、吳祖慶、袁慕云、陳碧
玲、陳夢琪、綦佩妍、陶平、彭淼曦、黃杰、聶丹丹、王藝凱、邱燁、劉鑫。
III
引 言
化妝品中病原菌可通過不同途徑進入機體，對消費者的健康帶來風(fēng)險。SN/T 5760—2024《進出
口化妝品中病原菌檢測方法 微滴式數(shù)字PCR 法》采用微滴式數(shù)字PCR 法，對化妝品中10 種代表性
病原菌進行檢測，旨在建立靈敏度高、抗干擾能力強的檢測方法，以保護消費者健康，促進化妝品進
出口貿(mào)易。SN/T 5760— 2024 由10 個部分組成：
——第1 部分：大腸埃希氏菌；
——第2 部分：金黃色葡萄球菌；
——第3 部分：銅綠假單胞菌；
——第4 部分：肺炎克雷伯氏菌；
——第5 部分：洋蔥伯克霍爾德菌；
——第6 部分：沙門氏菌；
——第7 部分：白色念珠菌；
——第8 部分：破傷風(fēng)梭菌；
——第9 部分：檸檬酸桿菌；
——第10 部分：嗜麥芽窄食單胞菌。
1
進出口化妝品中病原菌檢測方法 微滴式數(shù)字PCR 法
第5 部分：洋蔥伯克霍爾德氏菌
1 范圍
本文件描述了進出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德氏菌的微滴式數(shù)字PCR 檢測方法。
本文件適用于進出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德氏菌的快速檢測。
本文件所能達到的檢出限（LOD50）為 0.53 CFU/g（mL）~0.82 CFU/g（mL）。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文
件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適
用于本文件。
GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
GB 19489 實驗室 生物安全通用要求
GB/T 27403 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學(xué)檢測
SN/T 4684 進出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德氏菌檢驗方法
SN/T 5075 化妝品微生物檢驗制樣規(guī)范
3 術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4 縮略語
下列縮略語適用于本文件。
DNA ：脫氧核糖核酸（Deoxyribonuleic Acid）
ddPCR ：微滴式數(shù)字PCR（droplet digital Polymerase Chain Reaction）
PCR ：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）
5 方法原理
針對洋蔥伯克霍爾德氏菌1 號染色體，設(shè)計引物、探針，將一定濃度的引物、探針與模板DNA
及反應(yīng)預(yù)混液混合，配成PCR 反應(yīng)體系。將該數(shù)字PCR 體系分布到12 000 個~20 000 個微滴中，使
大部分微滴中模板DNA 分子的數(shù)量為1 或0，然后進行PCR 擴增。探針5’端標(biāo)記FAM 熒光基團，
3’端標(biāo)記BHQ1。利用數(shù)字PCR 系統(tǒng)的檢測通道，可對每個微滴的熒光信號進行采集分析。含有模
板DNA 的微滴出現(xiàn)熒光信號的增強，形成陽性微滴簇。最終根據(jù)陽性微滴的有無判定樣品中是否含
有洋蔥伯克霍爾德氏菌。
2
6 設(shè)備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
6.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃ ± 1 ℃。
6.2 冰箱：2 ℃ ~8 ℃、-20 ℃。
6.3 均質(zhì)器或乳液分散機（轉(zhuǎn)速1 000 r/min 以上）。
6.4 電子天平：感量0.1 g。
6.5 高速微量離心機（最大離心力不小于 10 000 g）。
6.6 渦旋振蕩儀。
6.7 加熱裝置：95 ℃ ~100 ℃。
6.8 核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。
6.9 無菌均質(zhì)袋或均質(zhì)杯。
6.10 生物安全柜。
6.11 ddPCR 擴增儀及相關(guān)配套設(shè)備。
6.12 移液器及配套吸頭：100 μL~1 000 μL、20 μL ~200 μL、10 μL ~100 μL、0.5 μL ~10 μL。
6.13 離心管：2 mL、1.5 mL 和 0.2 mL。
6.14 陽性對照：洋蔥伯克霍爾德氏菌 ATCC 25416 或等效菌株或含目的片段的DNA。
7 材料和試劑
7.1 僅使用分析純試劑和符合GB/T 6682 規(guī)定的一級水。所有試劑均用無DNA 酶污染的容器分裝。
7.2 DNA 提取液：見附錄A 中A.1。
7.3 含多粘菌素B 的大豆酪蛋白卵磷脂吐溫80（SCDLP）液體培養(yǎng)基：見附錄A 中A.2。
7.4 細(xì)菌基因組提取試劑盒。
7.5 生理鹽水：見附錄A 中A.3。
7.6 ddPCR 反應(yīng)配套試劑。
7.7 洋蔥伯克霍爾德氏菌1 號染色體特異性序列片段參見附錄B，引物探針如下：
Primer-F ：5’- CGATTTCAAGACGTTCGGC -3’
Primer-R ：5’- CTTGCGCGGATTCGACAG -3’
Probe-P ：5’-FAM- TCGGCGTCGGCAAGATGCAGG - BHQ1-3’
8 檢驗程序
進出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德氏菌ddPCR 檢驗程序見圖1。
3
圖1 進出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德氏菌檢驗程序
9 實驗操作步驟
9.1 樣品前處理
待測的樣品應(yīng)在室溫下保存，不要溫育、冷藏和冷凍樣品。樣品的制樣處理參照SN/T 5075 的規(guī)
定執(zhí)行。
9.2 增菌培養(yǎng)
吸取10 mL 1:10 樣品稀釋液接種到 90 mL 含多粘菌素B 的SCDLP 增菌液中，置于36 ℃ ±1 ℃培
養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h ～ 24 h。
9.3 DNA 提取
混勻增菌培養(yǎng)物，在其液面表層吸取1 mL，于 10 000 g~12 000 g 離心3 min，棄去上清液。必要
時，用生理鹽水清洗沉淀1 次~2 次。用1 mL 生理鹽水混懸沉淀，于10 000 g~12 000 g 離心3 min，
棄去上清液。在沉淀中加入 50 μL DNA 提取液振蕩混勻，于95 ℃ ~100 ℃加熱 10 min，室溫冷卻
2 min 后，于10 000 g~12 000 g 離心5 min，取上清液作為 DNA 模板。若不能及時分析，DNA 模板可
置于-20 ℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?br />
注: 若采用商品化 DNA 提取試劑盒，按其操作說明制備 DNA 模板。
9.4 DNA 濃度和純度測定
樣品DNA 使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測定260 nm 和280 nm 處的吸收值A(chǔ)260 和A280，
按照公式（1）計算DNA 的濃度。
ρ=A260×N×50 ……………………………（1）
4
式中：
ρ —— DNA 濃度，單位為納克每微升（ng /μL）；
A260—— 260 nm 處的吸光值；
N —— 核酸稀釋倍數(shù)。
A260/A280 在1.8 ~ 2.0 之間，DNA 濃度為0.01 ng/ μL~10 ng/ μL 時，適用 ddPCR 檢測。
9.5 ddPCR 檢測
9.5.1 對照和平行
檢測過程中分別設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。以洋蔥伯克霍爾德氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA 或
含目的片段的DNA 作為陽性對照，以非洋蔥伯克霍爾德氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA 作為陰性對照，用等體積
的一級水代替模板DNA 作為空白對照。每個待檢樣品提取的DNA 溶液進行3 個平行ddPCR 檢測。
9.5.2 反應(yīng)體系
按照表1 配制ddPCR 反應(yīng)體系。1）
表1 ddPCR 反應(yīng)體系
試劑名稱儲備液濃度終濃度
體積
μL
反應(yīng)預(yù)混液2× 1× 10.0
Primer-F 10 μmol/L 0.90 μmol/L 1.8
Primer-R 10 μmol/L 0.90 μmol/L 1.8
Probe-P 10 μmol/L 0.45 μmol/L 0.9
DNA 模板— — 2.0
水— — 3.5
體系總體積— — 20.0
9.5.3 微滴生成
將配制好的ddPCR 反應(yīng)混合液，加入微滴生成裝置加樣孔中，按儀器操作說明生成微滴。
9.5.4 ddPCR 擴增
將生成的微滴緩慢轉(zhuǎn)移至96 孔板中，封膜后置于PCR 儀上，按以下參數(shù)進行PCR 擴增：95 ℃
10 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，40個循環(huán)；98 ℃ 10 min，12 ℃ 10 min。升降溫速度設(shè)置為 ≤ 2 ℃ /s。
注：ddPCR 反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴增儀型號的不同進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
9.5.5 熒光信號讀取
擴增反應(yīng)結(jié)束后，將96 孔板放入ddPCR 檢測儀中對每個微滴進行熒光檢測，采用FAM 通道讀
取熒光信號。
1）非商業(yè)性聲明：本文件給出的反應(yīng)體系是使用伯樂設(shè)備完成的。給出這一信息是為了方便本文件使用者，并不表示對該產(chǎn)品
的認(rèn)可。如果其他產(chǎn)品具有相同的效果，那么可使用這些等效產(chǎn)品。
5
10 結(jié)果分析與表述
10.1 閾值的設(shè)定
根據(jù)空白對照的終點熒光值設(shè)定閾值限，閾值限應(yīng)對空白和陽性擴增結(jié)果進行明確的區(qū)分。
10.2 質(zhì)量控制
10.2.1 體系分隔產(chǎn)生的有效微滴的總數(shù)量滿足作用ddPCR 儀器型號要求。
10.2.2 陰性對照和空白對照無熒光信號檢出。
10.2.3 陽性對照有熒光信號檢出且陰性微滴簇與陽性微滴簇能夠截然分開。
10.2.4 以上質(zhì)控條件有一項不符合者，實驗結(jié)果視為無效，查找原因后再次進行ddPCR 檢測。
10.3 結(jié)果表述
10.3.1 待檢樣品所有微滴的熒光信號均低于閾值限，待測樣品中不含有洋蔥伯克霍爾德氏菌，檢測
結(jié)果表述為“ 每克或毫升未檢出洋蔥伯克霍爾德氏菌”。
10.3.2 待檢樣品3 個平行樣品中至少1 個平行樣品有熒光信號高于閾值限的陽性微滴，且陰性微滴
簇與陽性微滴簇能夠截然分開，該樣品結(jié)果為洋蔥伯克霍爾德氏菌初篩陽性，對樣品的增菌液進一步
按SN/T 4684 中的操作步驟進行確認(rèn)后報告結(jié)果。
11 生物安全和防污染措施
為保護實驗室人員的安全，應(yīng)由具備資格的工作人員進行檢測，所有培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)按照 GB
19489 中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。
防止交叉污染的措施應(yīng)按照 GB/T 27403 中的規(guī)定執(zhí)行。
6
附 錄 A
（規(guī)范性）
主要培養(yǎng)基和試劑
A.1 DNA 提取液
A.1.1 成分
Chelex-100 5.0 g
滅菌一級水 100 mL
A.1.2 制法
將Chelex-100 顆粒加入滅菌一級水中混勻，2 ℃ ~8 ℃ 保存。
A.2 含多粘菌素B 的大豆酪蛋白卵磷脂吐溫80（SCDLP）液體培養(yǎng)基
A.2.1 成分
酪蛋白胨 17.0 g
大豆蛋白胨 3.0 g
氯化鈉 5.0 g
磷酸氫二鉀 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
卵磷脂 1.0 g
吐溫80 7.0 g
蒸餾水 1 000 mL
A.2.2 制法
先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其他成分混合，加熱溶解，調(diào) pH 值為 7.2~7.3，
分裝，每瓶90 mL，121 ℃高壓滅菌 20 min。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80 充分混合，冷卻至
25 ℃左右使用。使用前，用過濾除菌方法加入多粘菌素B，使其終濃度為250 000 U/L。
注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
A.3 生理鹽水
A.3.1 成分
氯化鈉 8.5 g
蒸餾水 1 000 mL
A.3.2 制法
將氯化鈉在蒸餾水中溶解，121 ℃高壓滅菌15 min。
7
附 錄 B
（資料性）
洋蔥伯克霍爾德氏菌特異性基因序列片段
洋蔥伯克霍爾德氏菌1 號染色體序列（部分）及引物設(shè)計示意圖（GenBank No. CP020394.1）見圖 B.1。
CGATTTCAAGACGTTCGGCATCGGCGCGCAGATCCTGCGTGATGTCGGCGTCGGCAAGATGCAGGTGCTG
TCGAATCCGCGCAAGCTGGGCAGCATGTCCGGCTACGGCCTCGAAGTCACGGGCTTCATTCCGATGCCCG
GCGACGAAGCCAAGTCCTGCCCGGCGTCCAACGCGTAA
注：陰影部分分別為上下游引物序列，方框部分為探針序列。
圖 B.1 洋蔥伯克霍爾德氏菌1 號染色體序列（部分）及引物設(shè)計示意圖
